Zur Aktivierung von CD4⁺ T-Lymphozyten wird die Hilfe von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) benötigt. Das können z.B. dendritische Zellen oder Makrophagen sein. APCs nehmen Antigene aus ihrer Umgebung auf, verdauen diese zu Peptiden und präsentieren diese Peptide gebunden an MHC-Klasse-II Moleküle auf ihrer Zellmembranoberfläche. Die Bindung des T-Zellrezeptors (TZR) an diese Peptid-MHC Komplexe setzt in den T-Zellen eine Kaskade von Phosphorylierungen in Gang (z.B. Lck, Zap70, LAT) und führt zur Aktivierung von Phospholipase C (PLCγ). Letztere bewirkt die Ausschüttung intrazellulären Ca²⁺ aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und es erfolgt ein Einstrom von Ca²⁺ aus dem Extrazellulärraum in das Zytosol der Zelle durch CRAC Kanäle in der Plasmamembran. Der erhöhte Kalziumspiegel im Zytosol der T-Zelle aktiviert die Phosphatase Calcineurin, welche das Protein NFAT (nuclear factor of activated T cells) dephosphoryliert. Dadurch wird NFAT in den Zellkern transloziert und bindet dort an spezifische Promotoren um die Transkription von Zielgenen zu aktivieren (z.B. IL-2, IFNγ). Diese Gene sind essentiell für die Differenzierung von T-Zellen und die Ausübung ihrer Effektorfunktionen.

Der N-terminale Teil von NFAT gekoppelt an ein fluoreszentes Protein kann durch retrovirale Transduktion in Effektor-T-Zellen exprimiert werden. Dadurch ist es möglich, den Aktivierungsprozess mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops durch Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen live zu verfolgen (Animation 1). Im Video werden dendritische Zellen (in rot) gezeigt, die aus dem Knochenmark eines RFP-transgenen Tieres isoliert wurden. Diese werden dazu verwendet, MBP-spezifischen TNFAT-YFP/CherryH2B Zellen MBP-Peptide zu präsentieren. Der Kontakt einer T-Zelle mit einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) induziert eine sofortige Translokation von NFAT in den Zellkern (gelb).

Meningeale und perivaskuläre Makrophagen sind die ersten APCs, auf die T-Zellen nach dem Überqueren der Blut-Hirn-Schranke und dem Eintritt in den perivaskulären/meningealen Raum treffen. Diese Zellen sind myeloiden Ursprungs und können mit Hilfe von Knochenmarkchimären (durch Rekonstitution mit GFP-exprimierenden hämatopoetischen Stammzellen) sichtbar gemacht werden (Animation 2 & 3). Im Gegensatz zu Mikroglia exprimieren die meningealen und perivaskulären Makrophagen eine hohe Anzahl an MHC-Klasse-II Molekülen auf ihrer Oberfläche.
Meningeale Makrophagen nehmen sehr effizient Makromoleküle auf (z.B. fluoreszentes Dextran (Animation 3 und 4) und lösliche Antigene. Diese Eigenschaft kann man sich zunutze machen, um die Zellen im Tier zu markieren und ihre Interaktion mit T-Zellen durch intravitale 2-Photonenmikroskopie im Rückenmark zu verfolgen.

Der Transfer von MBP-spezifischen T-Zellen führt zur Induktion einer EAE in Lewis Ratten. Sind diese T-Zellen mit dem doppelt fluoreszenten Reporter NFAT/H2B ausgestattet, kann man diese kurz vor Einsetzen der ersten klinischen Symptome in den Meningen des Rückenmarks (Animation 4) visualisieren. Nach der Extravasation aus den Blutgefäßen, kriechen die T-Zellen entlang der pialen Gefäße und treffen dort auf die meningealen Makrophagen. Nach Kontakt nicht aktivierter T-Zellen (grauer Pfeil) mit TxR-Dextran markierten Makrophagen verlagert sich das zytosolische NFAT in den Zellkern (gelber Kreis). Dadurch kann man Echtzeitmessungen von T-Zellaktivierung im lebenden Tier durchführen und diese quantifizieren.

Antigenrezeptoren, die auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert werden, sind im Genom in speziellen Segmenten organisiert, die während der T-Zellentwicklung durch V(D)J Rekombination zu funktionellen Einheiten zusammengefügt werden.

In einem normalen Immunrepertoire erkennen jeweils nur wenige T-Zellen ein spezifisches Antigen. Durch genetische Manipulation wurden Mäuse generiert, die ein T-Zellrepertoire besitzen, das spezifisch für ein einziges Antigen ist. Damit wurden diese T-Zellrezeptor transgenen Mäuse zu einem sehr nützlichen Werkzeug in der immunologischen Forschung. Wir arbeiten an der Erschaffung von T-Zellrezeptor (TZR)-transgenen Lewis Ratten für verschiedene Antigene, darunter auch Autoantigene die im Nervengewebe exprimiert werden. Für die Klonierung der spezifische T-Zellrezeptoren, müssen zuerst DNA Sequenzen für deren α- und β-Kette identifiziert werden. Dazu verwenden wir T-Zellkulturtechniken, um klonale Populationen zu erzeugen. Die so erhaltenen Sequenzen werden in lentivirale Expressionsvektoren kloniert und in TZR-negativen Hybridomlinien auf ihre Antigenreaktivität getestet. Lentiviren mit funktionellem TZR werden dann durch Transgenese von Rattenembryos im Präimplantationsstadium zur Generierung der transgenen Rattenstämme verwendet.

Vor kurzem konnten wir mit Hilfe dieser Techniken transgene Lewis Ratten generiert, die einen TZR spezifisch für das β-Synukleinprotein der Ratte exprimieren (Lodygin, Hermann et al., 2019). Mit diesem Rattenmodell konnten wir zeigen, dass T-Zellen, die ein neuronales Autoantigen (β-Synuklein) erkennen, eine Entzündung in der grauen Substanz des ZNS hervorrufen. Im Gegensatz dazu lösen Myelin-spezifischen T-Zellen eine Entzündung in der weißen Substanz des ZNS aus. Außerdem konnten wir in unseren transgenen Tieren zeigen, dass wiederholte Attacken von CD4 T-Effektorzellen mit einer bleibenden Gliose, neuronalen Schäden und kortikaler Gehirnatrophie einhergehen. Somit kann dieses neue Tiermodell dazu verwendet werden, Mechanismen in autoimmunen Erkrankungen des ZNS zu verstehen, die mit fortschreitenden Schädigungen einhergehen.

Nach Bindung von Molekülen an Immunrezeptoren, wie z.B. dem T-Zellrezeptor, erfolgt eine Erhöhung der Ca²⁺ Konzentration im Zytosol der Zelle. Diese Ca²⁺-Erhöhung aktiviert wiederum verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie z.B. NFAT, CREB und NF-kappaB, welche die Expression von Genen regulieren, die für die Funktion von T-Zellen essentiell sind. Der Anstieg an intrazellulärem Ca²⁺ erfolgt hauptsächlich durch „store-operated“ Kalziumeinstrom (SOCE) und „calcium-release-activated“ Kalziumkanäle (CRAC).

Das endoplasmatische Retikulum (ER) und saure Endosomen/Lysosomen sind intrazelluläre Kalziumspeicher. Da das ER von T-Zellen relativ klein ist, bewirkt eine Ca²⁺ Freisetzung daraus nur eine moderate und transiente Erhöhung von zytoplasmatischem Kalzium. Die damit einhergehende Entleerung der Kalziumspeicher führt zur Aktivierung der CRAC Kanäle in der Plasmamembran und bewirkt einen massiven Einstrom von extrazellulärem Ca²⁺.

Die Entleerung der Kalziumspeicher kann auf verschiedene Arten ausgelöst werden, z.B. durch „second messenger“ wie Inositol-1,4,5-triphosphat (InsP3), zyklische ADP Ribose (cADPR) oder Nicotinsäure-adenindinukleotid-phosphat (NAADP). Diese „second messenger“ Moleküle werden nach Aktivierung des T-Zellrezeptors und Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen gebildet. Vor kurzem konnten wir BZ194 als einen Inhibitor von NAADP identifizieren, der in der frühen Phase der T-Zellaktivierung wirksam ist (Dammermann et al., PNAS 2009). Die klinischen Symptome in Lewis Ratten konnten in aktiver und Transfer- EAE sowohl durch präventive als auch therapeutische Gabe von BZ194 verbessert werden. Damit könnte der NAADP -> Ca²⁺ Signalweg einen neuartigen Angriffspunkt für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen darstellen (Cordiglieri et al., 2010).

Zurzeit untersuchen wir die Rolle anderer Ca²⁺ -freisetzender Kanäle und Molekule, z.B. die Ryanodinrezeptoren (RyR) in der EAE.